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近日，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院科研團(tuán)隊(duì)開(kāi)展的“通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的機(jī)制”的研究成果正式在《Frontiers in Pharmacology》雜志（2022年影響因子/JCR分區(qū)；5.988/Q1）上發(fā)表。

▲ 圖 | 康臣玉林制藥雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎研究成果榮登《Frontiers in Pharmacology》雜志

研究背景

雞骨草膠囊內(nèi)含三七、人工牛黃、豬膽汁、牛至、毛雞骨草、白芍、紅棗、梔子、茵陳等多種治肝養(yǎng)肝的優(yōu)質(zhì)中藥材，可疏肝利膽、清熱解毒，用于急、慢性肝炎和膽囊炎屬肝膽濕熱證者。另有臨床研究表明，雞骨草膠囊 可用于治療慢性乙型肝炎，但其產(chǎn)生療效的作用機(jī)制尚未完全闡明。該研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，探討雞骨草膠囊治療乙肝病毒感染的機(jī)制。

研究方法

本研究采用質(zhì)譜（MS）技術(shù)鑒定雞骨草膠囊的活性代謝物，并通過(guò)尾靜脈高壓水注射HBV復(fù)制質(zhì)粒建立HBV體內(nèi)復(fù)制小鼠模型。使用脂質(zhì)體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率，定量檢測(cè)HBV-s抗原（HBsAg）和HBV-e抗原（HBeAg）水平，qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)基因表達(dá)和蛋白表達(dá)；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究獲得雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的關(guān)鍵通路和關(guān)鍵基因。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

01 雞骨草膠囊及其含藥血清分別鑒定出92個(gè)和23個(gè)化合物，兩者成分進(jìn)行對(duì)比分析，推測(cè)7, 3’, 4’ -三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸可能是其主要活性代謝物。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊及其含藥血清的總離子色譜圖

02 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雞骨草膠囊可降低HBV體內(nèi)復(fù)制小鼠血清HBsAg水平。HE染色結(jié)果顯示，各組肝臟組織均無(wú)明顯損傷；免疫組化（IHC）結(jié)果顯示，雞骨草膠囊干預(yù)組的肝臟組織中HBsAg表達(dá)水平明顯降低。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊加速HBV復(fù)制C57BL/6J小鼠血清和肝臟組織中HBsAg的消除

03 雞骨草膠囊可降低HepG2.2.15和HepAD38細(xì)胞上清液中HBsAg的水平和細(xì)胞中HBx的mRNA的表達(dá)，并可抑制HepG2.2.15和HepAD38細(xì)胞的增殖，而不影響HepG2和Huh7細(xì)胞的增殖。這表明，其可直接抑制細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制，進(jìn)一步抑制HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖。

▲圖 | 雞骨草膠囊體外抑制HBV的復(fù)制和HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖

04 雞骨草膠囊可抑制HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7和HEK-293T細(xì)胞中HBeAg的表達(dá)，同時(shí)抑制過(guò)表達(dá)HBx的Huh7和HEK-293T細(xì)胞的增殖。這表明，雞骨草膠囊可能依賴(lài)HBx基因的表達(dá)而抑制HBV的復(fù)制。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊抑制HBx表達(dá)非肝細(xì)胞的增殖

05 根據(jù)對(duì)雞骨草膠囊的UHPLC-MS/MS分析，Swiss目標(biāo)預(yù)測(cè)鑒定出663個(gè)靶基因，STITCH鑒定出292個(gè)靶基因。去除重復(fù)基因后，最終共鑒定出905個(gè)靶基因。利用維恩圖工具上傳雞骨草膠囊的潛在靶點(diǎn)和CHB的疾病靶點(diǎn)提取719個(gè)重疊基因（OEGs），網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示雞骨草膠囊作用的關(guān)鍵基因主要是CASP3、CXCL8、EGFR、HSPA8、IL6、MDM2、MMP9、NR3C1、PTGS2等，這些基因之間存在一定關(guān)系。

▲ 圖 | 雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎的網(wǎng)絡(luò)藥理分析

06 KEGG富集分析表明，雞骨草膠囊潛在的靶基因主要與代謝途徑、癌癥途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)，關(guān)鍵基因主要參與癌癥通路、膀胱癌中的microRNAs等。GO富集分析結(jié)果表明，雞骨草膠囊潛在靶基因的富集生物過(guò)程主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化、氧化還原過(guò)程等相關(guān)，關(guān)鍵基因與多種GO- BP顯著相關(guān)，包括凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、藥物應(yīng)答、細(xì)胞增殖的正調(diào)控等?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，癌癥、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和癌癥中的蛋白多糖的途徑都在潛在靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)中富集。由此推測(cè)，雞骨草膠囊可能調(diào)節(jié)了CHB相關(guān)的通路，這些生物過(guò)程和信號(hào)通路可能與雞骨草膠囊治療慢性乙型肝炎作用有關(guān)。

▲ 圖 | OGEs和關(guān)鍵基因的KEGG和BP功能富集

 研究結(jié)論

體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，雞骨草膠囊具有抑制HBV復(fù)制的作用，同時(shí)抑制HBV復(fù)制肝癌細(xì)胞系的增殖，其關(guān)鍵代謝產(chǎn)物為3’, 4’, 7-三羥基黃酮、膽酸和脫氧膽酸，作用機(jī)制可能與癌癥通路、乙型肝炎、癌癥中的microRNAs、PI3K-Akt信號(hào)通路和癌癥通路中的蛋白聚糖有關(guān)。本研究為雞骨草膠囊的臨床應(yīng)用提供了更廣泛的證據(jù)支持。